DNA甲基化是表观遗传修饰的重要组成之一、在动物、植物和微生物的生长发育、基因表达调控以及抗逆胁迫中起着至关重要作用。植物中约有20-30%的基因组胞嘧啶处于甲基化状态，并分布于CG，CHG和CHH位点（H= A、G或T）。随着功能基因组学研究的深入，植物基因组DNA甲基化研究已经成为该领域的研究热点之一，而且开发出了一系列的DNA甲基化检测方法。根据研究内容和目的的不同，可分为检测全基因组甲基化和特异性位点甲基化两类方法，其中后者研究方法主要使用重亚硫酸盐限制酶组合分析（COBRA）、甲基化特异性PCR（MSP）和重亚硫酸盐测序法（Bisulfite Sequencing）为主。然而，随着上述方法在植物上的不断应用，发现其中仍然存在一些较棘手的技术性问题，如：植物基因组CG含量高；基因组DNA修饰后，未甲基化的C变成T，再配合原序列中的T，致使T碱基的丰度极高，从而导致植物特异性位点引物极难设计/无法设计引物；DNA目的片段重亚硫酸盐修饰后扩增结果不理想和测序后甲基化率不稳定。目前，几乎suo的生物技术公司均不提供植物甲基化引物方面的设计服务，动物甲基化研究中的焦磷酸测序和飞行质谱测序均无法在植物中应用，也间接说明甲基化引物设计的难度很高。
土壤污染生态组博士后王鹤潼等在刘宛研究员的指导下，通过设计大量引物，发现17 ~ 30 bp短引物较宜使用Touch-down程序PCR，但特异性差、成功率低；31 ~ 50 bp长引物使用55℃退火60℃延伸的PCR条件其成功率最高，其中反向引物的长度及Tm小于正向引物较佳；高保真酶因其3’→5’外切酶活性不宜用于甲基化研究，而EpiTaq？ HS在PCR结果中表现最佳。本研究首次对植物特异性位点甲基化研究中的难点引物设计问题进行了方法性探讨，总结了2类引物的设计方法及原则，为植物特异性位点甲基化研究提供了方法性依据和指导。该改良方法的文章《植物位点特异性甲基化研究的引物设计及PCR体系优化》已发表于《农业环境科学学报》（已接受）。
目前，植物全基因组甲基化研究方法主要以芯片技术、高效液相色谱法、基于甲基化敏感内切酶（如：Methylation Sensitive Amplification Polymorphism，MSAP和Methylation-sensitive Arbitrarily Primed PCR， MSAP-PCR等）和基于Southern探针杂交（如：CGI array和cDNA microarray等）的方法为主。由于芯片技术需要开发大量探针且成本较高，而高效液相色谱法条件优化较复杂。土壤污染生态组还研究出了植物全基因组甲基化研究新的测定方法-改进MSAP-PCR技术（改进MSAP-PCR技术应用于Cd胁迫下拟南芥DNA 甲基化分析，农业环境科学学报，2015，34：1618-1624）。
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王鹤潼博士等应用改进的MSAP-PCR、简单序列重复（SSR）和随机引物扩增多态性（RAPD）技术，研究了Cd胁迫下拟南芥幼苗基因组DNA损伤的变化趋势。结果发现: (1) 0.25、1.0、4.0和5.0 ppm Cd胁迫15天后，拟南芥幼苗全基因组的甲基化多态性、CpG位点和CHG位点甲基化位点数均明显增加，表现为倒U字型变化趋势。(2) 4.0 ppm Cd胁迫15天后，幼苗表现为微弱的RAPD多态性; 5.0 ppm Cd胁迫15天后，0.25和1.0ppm处理21天幼苗均表现为较高的RAPD多态性。(3) 0.25-5.0 ppm Cd胁迫15天后，使用46对SSR引物没有检测出SSR变异；8.0ppm Cd胁迫15天后产生一个重复序列的SSR变异。上述结果表明，对Cd胁迫最敏感性的生物标记物是甲基化化多态性MSAP-PCR，RAPD多态性次之，SSR多态性最差。该研究对Cd污染土壤/水体的早期预警和早期诊断提供了重要的参考价值。研究结果Cadmium-induced genomic instability in Arabidopsis: molecular toxicological biomarkers for early diagnosis of cadmium stress在线发表于环境类杂志Chemsphere ( 2016, 150: 258-265)。 文章链接： 12 |
